低温是严重影响植物生长发育、限制作物产量和品质的一个重要环境因子。水稻是东亚重要的禾谷类作物，为世界一半以上的人口提供食物，已经成为研究作物基因资源较为理想的单子叶模式植物。然而，水稻是喜温作物，对冷敏感，水稻冷害在许多国家都是一种普遍存在的现象。黑龙江省(东经121°11’~135°05’, 北纬43°25’~53°33’)是世界最北寒地稻作区，水稻冷害现象尤为突出，具有周期性和群发性，已成为黑龙江水稻生产不稳定的重要原因(Xiang et al., 2013)。挖掘抗冷基因资源，探明其在转基因水稻中的调控作用，对黑龙江水稻安全生产具有重要的理论和现实意义。

近年来，国内外学者对植物抗寒性进行了较为广泛的研究。许多植物在遭受非冰冻低温后，会诱导一些冷诱导基因(cold-responsive genes, COR)表达，形成一套低温冷驯化应答反应机制，改进植物的抗寒能力(Guy, 1990)。COR基因表达的转录调控对植物的冷应答反应是至关重要的，转录因子与COR基因启动子上的顺式作用元件的相互作用已被证明是诱导COR基因表达的关键步骤(Shinozaki et al., 2003)。一些COR基因的启动子上含有C重复元件(C-repeat, CRT)或脱水反应元件(dehydration-responsive element, DRE)，其核心序列为A/GCCGAC。CBF/ DREB1转录因子作为COR基因的控制开关，其能与CRT/DRE顺式元件结合，激活一系列COR基因的表达，提高转基因拟南芥、水稻和小麦的抗寒性(Jaglo-Ottosen et al., 1998; Pellegrineschi et al., 2004; Ito et al., 2006)。然而CBF/DREB1的表达需冷诱导，这种冷诱导不受其自身调控，先于COR基因与CRT/DRE元件结合作用，说明CBF/DREB1基因存在上游调控因子。拟南芥ICE1基因编码一种碱性-螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)转录因子，其蛋白在冷胁迫下被磷酸化、脱磷酸化和泛素化作用等转录后修饰后，能够特异结合CBF3启动子上的MYC识别序(CANNTG)列上，激活CBF-COR冷反应通路，提高转基因拟南芥的抗寒性(Chinnusamy et al., 2003)。ICE1基因及其同源基因对CBF/DREB1基因的调控作用在一些植物中是保守的，在一定程度上提高了转基因植物的抗寒性(Badawi et al., 2008; Li et al., 2010; Jiang et al., 2011)。

鉴于ICE1和ICE1-like转录因子在植物抗冷中的重要调控作用，本研究从大白菜中分离了一个ICE1-like基因BcICE1，并获得了转基因抗冷水稻株系(向殿军等, 2011a; 2011b)。本研究旨在通过探明BcICE1基因的表达模式、BcICE1基因在T₁代水稻中整合和表达情况以及BcICE1基因在水稻中是否参与调控OsDERB1冷反应通路，揭示BcICE1基因的抗寒机制，为研究水稻抗寒机制奠定了基础和进一步利用该基因改良植物抗寒性提供基因资源，从而为培育抗寒性强、优质的作物品种提供科学依据。

1结果与分析
1.1 BcICE1基因表达模式分析
利用半定量RT-PCR方法分析大白菜BcICE1基因在不同器官和处理条件下的响应模式。结果表明，BcICE1基因在大白菜的根、茎、叶中均有表达，根的表达量较弱，茎和叶的表达量较强(图1A)。BcICE1基因是冷差异表达基因，4℃处理12 h表达量达到最高；BcICE1基因对盐胁迫敏感，200 mmol/L NaCl处理6 h后，其表达量急剧上升，在18 h表达量达到最高；BcICE1基因的表达量能被外源ABA上调，但脱水处理对BcICE1基因的表达量几乎没有影响，表明BcICE1基因对脱水胁迫不敏感(图1B)。

图1 BcICE1基因表达模式 注: A: 组织表达分析; B: 冷, 脱水, 氯化钠和脱落酸处理表达分析 Figure 1 Expression patterns of BcICE1 gene Note: A: The tissues expression of BcICE1; B: The expression of BcICE1 under cold, dehydration, NaCl and ABA treatments

1.2 T₁代水稻潮霉素抗性分离
χ²测验结果表明，12个T₀代转基因植株自交种子(T₁代)均发生了潮霉素抗性分离(表1)。其中，T₁L17、T₁L20、T₁L22、T₁L23和T₁L25植株种子潮霉素抗感分离比均不符合3:1，目的基因可能以非单拷贝、单位点形式整合到水稻基因组中；其余植株种子潮霉素抗感分离比符合3:1，目的基因可能以单拷贝、单位点形式整合到水稻基因组中。

表1 转基因水稻T1代外源基因分离模式的χ2检测 Table 1 χ2 test for separation model of exogenous gene in T1 rice lines

1.3外源基因整合情况分析
随机选取χ²测验分离比符合3:1且抗寒性鉴定中存活率较高的3个转基因株系T₁L19、T₁L21和T₁L26 (向殿军等, 2011b)，提取基因组DNA进行Southern杂交。结果显示，未转基因对照植株未出现杂交条带，酶切载体和转基因水稻植株均出现杂交条带(图2)，而且外源基因均是以单拷贝单位点形式整合，与χ²测验结果完全一致。

图2 T1代转基因水稻植株的Southern杂交检测 注: 1: 未转化的水稻植株(阴性对照); 2: SalⅠ酶切质粒产物(阳性对照); 3~5: 转基因水稻株系T1L19, T1L21和T1L26 Figure 2 Southern blot analysis of T1 rice lines Note: 1: Non-transgenic rice plants (negative control); 2: SalⅠ enzyme cutting product of plasmid (positive control); 3~5: The transgenic rice lines T1L19, T1L21, T1L26

1.4外源基因表达分析
为了检测BcICE1基因在转基因植株中是否正常表达，提取3个转基因株系T₁L26、T₁L19和T₁L21的水稻总RNA进行Northern杂交。结果表明，非转基因水稻植株没有杂交信号产生，而转基因株系均有特异的杂交信号产生(图3)，表明目的基因BcICE1基因已经整合到水稻基因组中，实现了转录。BcICE1基因的表达在3个T₁代转基因水稻株系积累程度不同，转基因水稻株系T₁L26中BcICE1基因的mRNA积累水平较高。

图3 T1代转基因水稻植株的Northern杂交检测 注: 1: 未转化的水稻植株(阴性对照); 2~4: 转基因水稻株系T1L26, T1L19和T1L21 Figure 3 Northern blot analysis of T1 rice plants Note: 1: Non-transgenic rice plants (negative control); 2~4: The transgenic rice lines T1L26, T1L19, T1L21

1.5转基因水稻冷反应基因的表达分析
拟南芥ICE1是通过调控CBF3通路来提高拟南芥抗寒能力的(Chinnusamy et al., 2003)，而BcICE1基因在保守区域与拟南芥ICE1分享较高的相似性(向殿军等, 2011a)，所以推断外源基因BcICE1在转基因水稻中也可能是通过OsDREB1途径来改进转基因水稻抗低温能力的。为了证明这一推测，提取外源基因表达量较高的株系T₁L26和未转基因水稻植株(WT)的总RNA，利用实时定量RT-PCR来分析BcICE1基因超表达对水稻冷诱导基因OsDREB1A、OsDREB1B和OsDREB1F的影响。冷处理24 h和48 h后，OsDREB1F、OsDREB1B和OsDREB1A基因的转录水平均被迅速上调，株系T₁L26和未转基因水稻植株间的OsDREB1A和OsDREB1B基因转录水平差异不明显(P>0.05) (图4A; 图4B)，但是，株系T₁L26的OsDREB1F基因的转录水平明显高于未转基因水稻植株(P<0.05) (图4C)，表明BcICE1基因对转基因水稻抗寒性的影响是依赖OsDREB1冷反应通路的。

图4 冷诱导基因OsDREB1A (A), OsDREB1B (B)和OsDREB1F (C)表达分析 Figure 4 Expression analysis of cold regulatory genes OsDREB1A (A), OsDREB1B (B) and OsDREB1F (C)

2讨论
低温、干旱和高盐胁迫能诱导植物中许多应答基因表达，这些胁迫应答基因一些可以被ABA调控，而一些不可以被ABA调控，说明胁迫应答基因表达信号传导包括依赖ABA的信号转导途径和非依赖ABA的信号转导途径二种(Shinozaki et al., 2003)。植物激素ABA具有广泛的生物学功能，参与植物生长发育各个阶段以及植物应对环境胁迫的分子调控过程。BcICE1基因表达被ABA所上调，据此结果推测至少有一条依赖ABA的信号转导途径参与BcICE1胁迫应答。此外，BcICE1基因为组成型表达，在茎和叶的表达量较强，冷和盐胁迫能上调BcICE1基因表达水平，与拟南芥ICE1转录因子的表达模式极为相似(Chinnusamy et al., 2003)，为二者在抗冷途径中具有相似功能提供了理论依据。

水稻的耐冷性是一个极为复杂的生物适应现象，涉及转录调控、生理生化以及形态结构等方面一系列的变化过程，通过转基因手段来提高水稻的耐低温能力已证明是一种有效途径。转录因子可以与一些功能基因的启动子的顺式作用元件相互作用，调控多基因表达。因此，发现在植物抗寒过程中扮演重要作用的转录因子，将这些基因在水稻中进行超表达，以研究和分析这些基因的功能，可以揭示植物抗寒的分子机理、代谢调控途径及信号传导途径，对于加速水稻抗寒育种具有重要意义。ICE1-like基因家族成员广泛存在小麦(Badawi et al., 2008)、盐芥(轩春雷等, 2010)和杨树(林元震等, 2007)等植物中，这些ICE1-like基因也具有拟南芥ICE1基因类似功能，获得了一些转ICE1和ICE1-like基因的抗寒植物(郑银英等, 2009; 张玉等, 2010; Miura et al., 2007; Liu et al., 2010; Chinnusamy et al., 2003; 向殿军等, 2011b)。本研究结果表明，BcICE1基因可以上调OsDREB1F基因的转录水平，这在过表达ICE1、TaICE41和TaICE87基因拟南芥中也有类似的报道(Chinnusamy et al., 2003; Badawi et al., 2008)，但是OrbHLH001基因的超表达没有增加拟南芥CBF1、CBF2、CBF3、RD29A和COR47的超表达(Li et al., 2010)。因此，可将ICE1和ICE1-like基因在转基因植物冷反应通路中的调控作用可以分为两类：一类是依赖CBF/DREB1冷反应通路，即ICE1和ICE1-like基因作为总开关调控CBF/DREB1基因超表达，CBF/DREB1转录因子再诱导与冷有关的功能COR基因表达，提高植物的抗寒性；另一类是不依赖CBF/DREB1冷反应通路，即ICE1和ICE1-like基因不通过CBF/DREB1基因的调控作用，直接诱导低温应答基因的表达来改进植物的抗寒性。

在常温条件下，BcICE1基因没有上调了OsDREB1F转录水平(图4C)，推测BcICE1蛋白活性常温处于不活跃状态，以无效激活转录的形式存在，需在冷胁迫下经磷酸化、脱磷酸化、泛素化或类泛素化等转录后修饰才具有活性。丝氨酸磷酸化或脱磷酸化在激活拟南芥ICE1蛋白活性方面起着重要的作用(Chinnusamy et al., 2003)。BcICE1蛋白有19个丝氨酸可能成为磷酸化位点(向殿军等, 2011a)，位置和数目与拟南芥ICE1蛋白及其相似，暗示二者具有相似的磷酸化作用。HOS1泛素E3连接酶作用于拟南芥ICE1，进行蛋白酶降解，对ICE1活性起到负调控作用(Dong et al., 2006)。SIZ1 SUMO E3连接酶对ICE1蛋白的K393氨基酸进行类泛素化，抑制ICE1降解，对ICE1蛋白活性起到正调控作用(Miura et al., 2007)。BcICE1蛋白存在一个潜在的磷酸化位点(VKEE)，与拟南芥ICE1蛋白的磷酸化位点完全一致，推测BcICE1蛋白活性在水稻中也被SIZ1 SUMO E3连接酶管理。Park等(2010)在水稻中鉴定了2个具有泛素化功能的SIZ1同源基因(OsSIZ1和OsSIZ2)，BcICE1蛋白活性是否被OsSIZ1和OsSIZ2基因所调控有待近一步的研究。

3材料和方法
3.1材料
大白菜(Brassica pekinensis)品种为黑龙江省神州种业培育的神州五号杂交种。植物材料为T₁代转BcICE1基因的粳稻品种龙粳24。总RNA提取试剂TRNzol为TIANGEN公司产品；PrimeScript 1^st Strand cDNA Synthesis Kit为TaKaRa公司产品；潮霉素B购自北京鼎国生物技术有限责任公司，DIG标记和检测试剂盒、杂交液和尼龙膜均购自Roche公司。半定量RT-PCR引物为BcICE1f：5’-AGAAAGGGATGCCTGCTAAG-3’；BcICE1r：5’-TCAAGCTCGTTGTGAAGGTC-3’。Bcactinf：TTTCTTCTTCGATCCCATCTTC，Bcactinr：TCTTGGCCTACCAACAACACTA。实时定量RT-PCR引物为OsDREB1Af：5’-TGAGTGACATGGGCTGGGACC-3’；OsDREB1Ar：5’-TGGCATCGGAAGCCAGAAAAG-3’；OsDREB1Bf：5’-TGCCTCAACTTCGCCGACTTC-3’；OsDREB1Br： 5’-TGGCTTCTTCTTCGTCGCCAT-3’；OsDREB1Ff： 5’-ATCCGCAGGAAGGCACGAGC-3’；OsDREB1Fr： 5’-TCATCGTCGTCGTCGATGGC-3’；Osactinf：5’-GGTCGTACCCAAGGTAATGT-3’；Osactinr：5’-TGAATGAGTAACCACGCTCC-3’，均由上海生工生物工程有限公司合成。

3.2半定量RT-PCR分析BcICE1基因表达模式
将大白菜种子灭菌后，接种到1/2MS培养基上，26℃，16 h光照培养。提取根、茎和叶总RNA，以Bcactin1基因(FJ969844)作为内参，进行半定量RT- PCR分析BcICE1基因表达情况。将幼苗进行7% PEG6000处理、4℃冷处理、200 mmol/L NaCl处理、100 μmol/L ABA处理0、6 h、12 h、18 h、22 h、24 h和48 h，提取叶片总RNA，利用半定量RT-PCR，检测BcICE1基因在各处理下的响应模式。扩增条件为94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 1.5 min，30个循环；72℃ 10 min。

3.3 T₁代水稻潮霉素抗性分析
在每个T₀代转基因植株上随机选取3个穗作为3次重复，将种子(T₁代)灭菌后，接种到添加100 μg/mL潮霉素的MS培养基上，以未转基因植株种子作为对照，10 d左右统计发芽和未发芽种子数目，利用公式χ²=(|A-3a|-2)²/3(A+a)计算χ²值。A为发芽的种子数，a为未发芽的种子数，DF=1，a=0.05，χ²_{(0.05, 1)=}3.84。

3.4 T₁代转基因水稻Southern和Northern杂交
随机选取χ²测验分离比符合3:1且抗寒性鉴定中存活率较高的3个转基因株系T₁L19、T₁L21和T₁L26，提取其叶片总DNA，用SalⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳后固定在尼龙膜上，以DIG标记和检测试剂盒标记hptⅡ片段作为探针进行Southern杂交分析。阳性对照为SalⅠ酶切植物表达载体产物，阴性对照为未转基因水稻。以DIG标记和检测试剂盒标记BcICE1片段作为探针，提取水稻总RNA，电泳后固定在尼龙膜上，其余程序按Southern杂交程序进行Northern杂交分析。

3.5转基因水稻冷诱导基因表达分析
将外源基因表达量最高的株系T₁L26和未转基因水稻(WT)幼苗4℃冷处理0、24 h和48 h后，提取总RNA，以Osactin基因(X16280)作为内参，利用实时定量PCR来分析水稻冷诱导基因OsDREB1F、OsDREB1B和OsDREB1A的表达情况。按照Miura等(2007)方法对基因表达的相对变化进行定量，未转基因水稻(4℃处理0 h)的基因转录水平被设定为1。扩增条件为95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 40 s；40个循环。

作者贡献
向殿军和满丽莉是本研究的实验设计和实验研究的执行人；向殿军、王丽娜和张娣完成数据分析，论文初稿的写作；殷奎德和宋群雁参与实验设计，试验结果分析；徐正进是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家十二五科技支撑计划(2011BAD35B02)资助。作者感谢黑龙江八一农垦大学王北艳女士在本研究过程中提供的帮助。

参考文献
Badawi M., Reddy Y.V., Agharbaoui Z., Tominaga Y., Danyluk J., Sarhan F., and Houde M., 2008, Structure and functional analysis of wheat ICE (inducer of CBF expression) genes, Plant Cell Physiol., 49(8): 1237-1249

Chinnusamy V., Ohta M., Kanrar S., Lee B., Hong X.H., Agarwal M., and Zhu J.K., 2003, ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis, Genes Dev., 17(8): 1043-1054

Dong C.H., Agarwal M., Zhang Y., Xie Q., and Zhu J.K., 2006, The negative regulator of plant cold responses, HOS1, is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE1, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103(21): 8281-8286

Guy C.L., 1990, Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism, Ann. Rev. Plant. Physiol. Mol. Bio., 41(1): 187-223

Ito Y., Katsura K., Maruyama K., Taji T., Kobayashi M., Seki M., Shinozaki K., and Yamaguchi-Shinozaki K., 2006, Functional analysis of rice DREB1/CBF-type transcription factors involved in cold-responsive gene expression in transgenic rice, Plant Cell Physiol., 47(1): 141-153

Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., and Thomashow M.F., 1998, Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance, Science, 280(5360): 104-106

Jiang F.L., Wang F., Wu Z., Li Y., Shi G.J., Hu J.D., and Hou X.L., 2011, Components of the Arabidopsis CBF cold-responsive pathway are conserved in non-heading Chinese cabbage, Plant Mol. Biol. Rep., 29(3): 525-532

Li F., Guo S.Y., Zhao Y.A., Chen D.Z., Chong K., and Xu Y.Y., 2010, Overexpression of a homopeptide repeat-containing bHLH protein gene (OrbHLH001) from Dongxiang wild rice confers freezing and salt tolerance in transgenic Arabidopsis, Plant Cell Rep., 29(9): 977-986

Lin Y.Z., Zhang Z.Y., Liu C.X., Guo H., Zhu B.Q., and Chen X.Y., 2007, In silico cloning and analyzing of PslCEl from Populus suaveolens, a freezing-resistant transcription factor, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 5(3): 424-430 (林元震, 张志毅, 刘纯鑫, 郭海, 朱保庆, 陈晓阳, 2007, 甜杨抗冻转录因子ICEl基因的in silico克隆及其分析, 分子植物育种, 5(3): 424-430)

Liu L.Y., Duan L.S., Zhang J.C., Zhang Z.X., Mi J.Q., and Ren H.Z., 2010, Cucumber (Cucumis sativus L.) over-expressing cold-induced transcriptone regulator ICE1 exhibits changed morphological characters and enhances chilling tolerance, Sci. Hortic., 124(1): 29-33

Miura K., Jin J.B., Lee J., Yoo C.Y., Stirm V., Miura T., Ashworth E.N., Bressan R.A., Yun D.J., and Hasegawa P.M., 2007, SIZ1-mediated sumoylation of ICE1 controls CBF3/ DREB1A expression and freezing tolerance in Arabidopsis, Plant Cell, 19(4): 1403-1414

Park H.C., Kim H., Koo S.C., Park H.J., Cheong M.S., Hong H., Baek D., Chung W.S., Kim D.H., Bressan R.A., Lee S.Y., Bohnert H.J., and Yun D.J, 2010, Functional characterization of the SIZ/PIAS-type SUMO E3 ligases, OsSIZ1 and OsSIZ2 in rice, Plant Cell Environ., 33(11): 1923-1934

Pellegrineschi A., Reynolds M., Pacheco M., Brito R.M., Almeraya R., Yamaguchi-Shinozaki K., and Hoisington D., 2004, Stress-induced expression in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene delays water stress symptoms under greenhouse conditions, Genome, 47(3): 493-500

Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., and Seki M., 2003, Regulatory network of gene expression in the drought and cold stress responses, Curr. Opin. Plant Biol., 6(5): 410-417

Xiang D.J., Yin K.D., Man L.L., Chen W.F., Zhao M.H., and Xu Z.J., 2011a, Cloning and expression analysis of cold stress transcription factor BcICE1 from Brassica pekinensis, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 9(3): 364-369 (向殿军, 殷奎德, 满丽莉, 陈温福, 赵明辉, 徐正进, 2011a, 大白菜低温胁迫转录因子BcICE1的克隆及表达分析, 分子植物育种, 9(3): 364-369)

Xiang D.J., Yin K.D., Man L.L., Ke Q.B., Wang L.N., Chen W.F., Zhao M.H., and Xu Z.J., 2011b, Integratting the low temperature stress transcription factor BcICE1 gene into rice improves cold tolerance, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 9(6): 696-701 (向殿军, 殷奎德, 满丽莉, 可庆波, 王丽娜, 陈温福, 赵明辉, 徐正进, 2011b, 转低温胁迫转录因子BcICE1基因水稻提高抗寒性, 分子植物育种, 9(6): 696-701)

Xiang D.J., Man L.L., Yin K.D., Song Q.Y., Wang L.N., Zhao M.H., and Xu Z.J., 2013, Overexpression of a ItICE1 gene from Isatis tinctoria enhances cold tolerance in rice, Mol. Breeding, 32(3): 617-628

Xuan C.L., Xiao X.W., Li X.B., and Zhu J.B., 2010, Cloning and bioinformatics analysis of a transcription factor ICE1 from Thellungiella halophila, Shengwu Jishu Tongbao (Biotechnology Bulletin), (11): 108-114 (轩春雷, 肖向文, 李晓波, 祝建波, 2010, 盐芥ICE1转录因子的克隆及生物信息学分析, 生物技术通报, (11): 108-114)

Zhang Y., Jiang X.M., and Yu X.H., 2010, Research on transformation of the ICE1 gene to tomato mediated by Agrobacterium tumefaciens, Zuowu Zazhi (Crops), (5): 51-55 (张玉, 蒋欣梅, 于锡宏, 2010, 农杆菌介导的ICE1基因转化番茄的研究, 作物杂志, (5): 51-55)

Zheng Y.Y., Cui B.M., Chang M.J., and Peng M., 2009, Expression of AtlCEl gene in transgenic tobacco plants show increased tolerance to freezing stress, Xibei Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica), 29(1): 75-79 (郑银英, 崔百明, 常明进, 彭明, 2009, 转拟南芥ICEl基因增强烟草抗寒性的研究, 西北植物学报, 29(1): 75-79)